第一部分、保健食品評價試驗項目、試驗原則及結果判定

1 有助于增強免疫力功能

1.1 試驗項目

1.1.1 體重

1.1.2 臟器/體重比值測定：胸腺/體重比值，脾臟/體重比值

1.1.3 細胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細胞轉化實驗，遲發型變態反應實驗

1.1.4 體液免疫功能測定：抗體生成細胞檢測，血清溶血素測定

1.1.5 單核—巨噬細胞功能測定：小鼠碳廓清實驗，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

1.1.6 NK細胞活性測定

1.2 試驗原則

1.2.1 所列指標均為必做項目。

1.2.2 采用正常或免疫功能低下的模型動物進行實驗。

1.3 結果判定

有助于增強免疫力功能判定：在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核—巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于增強免疫力功能作用。

其中細胞免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性，可判定細胞免疫功能測定結果陽性。體液免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性，可判定體液免疫功能測定結果陽性。單核—巨噬細胞功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性，可判定單核—巨噬細胞功能結果陽性。NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定NK細胞活性結果陽性。

2 有助于抗氧化功能

2.1 試驗項目

2.1.1 動物實驗

2.1.1.1 體重

2.1.1.2 脂質氧化產物：丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素（8-Isoprostane）

2.1.1.3 蛋白質氧化產物：蛋白質羰基

2.1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過氧化物酶

2.1.1.5 抗氧化物質：還原型谷胱甘肽

2.1.2 人體試食試驗

2.1.2.1 脂質氧化產物：丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素（8-Isoprostane）

2.1.2.2 超氧化物歧化酶

2.1.2.3 谷胱甘肽過氧化物酶

2.2 試驗原則

2.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列的指標均為必測項目。

2.2.2 脂質氧化產物指標中丙二醛和血清8-表氫氧異前列腺素任選其一進行指標測定，動物實驗抗氧化酶指標中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶任選其一進行指標測定。

2.2.3 氧化損傷模型動物和老齡動物任選其一進行生化指標測定。

2.2.4 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

2.3 結果判定

2.3.1 動物實驗：脂質氧化產物、蛋白質氧化產物、抗氧化酶、抗氧化物質四項指標中三項陽性，可判定該受試樣品有助于抗氧化功能動物實驗結果陽性。

2.3.2 人體試食試驗：脂質氧化產物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項指標中二項陽性，且對機體健康無影響，可判定該受試樣品具有有助于抗氧化功能的作用。

3 輔助改善記憶功能

3.1 試驗項目

3.1.1 動物實驗

3.1.1.1 體重

3.1.1.2 跳臺實驗

3.1.1.3 避暗實驗

3.1.1.4 穿梭箱實驗

3.1.1.5 水迷宮實驗

3.1.2 人體試食試驗

3.1.2.1 指向記憶

3.1.2.2 聯想學習

3.1.2.3 圖象自由回憶

3.1.2.4 無意義圖形再認

3.1.2.5 人像特點聯系回憶

3.1.2.6 記憶商

3.2 試驗原則

3.2.1 動物實驗和人體試食試驗為必做項目。

3.2.2 跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗、水迷宮實驗四項動物實驗中至少應選三項，以保證實驗結果的可靠性。

3.2.3 正常動物與記憶障礙模型動物任選其一。

3.2.4 動物實驗應重復一次（重新飼養動物，重復所做實驗）。

3.2.5 人體試食試驗統一使用臨床記憶量表。

3.2.6 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

3.3 結果判定

3.3.1 動物實驗：跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗、水迷宮實驗四項實驗中任二項實驗結果陽性。且重復實驗結果一致（所重復的同一項實驗兩次結果均為陽性），可以判定該受試樣品輔助改善記憶功能動物實驗結果陽性。

3.3.2 人體試食試驗：記憶商結果陽性，可判定該受試樣品具有輔助改善記憶功能的作用。

4 緩解視覺疲勞功能

4.1 人體試食試驗項目

4.1.1 分別于試食前后進行眼部癥狀及眼底檢查，血、尿常規檢查，肝、腎功能檢查，癥狀詢問、用眼情況調查；于試驗前進行一次胸片、心電圖、腹部B超檢查。

4.1.2 明視持久度

4.1.3 視力

4.2 試驗原則

4.2.1 受試樣品試食時間為60天。

4.2.2 所列指標均為必做項目。

4.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

4.3 結果判定

4.3.1 試驗組自身比較或試驗組與對照組組間比較，癥狀改善且癥狀總積分差異有顯著性（P<0.05）。

4.3.2 試驗組自身比較或試驗組與對照組組間比較，明視持久度差異有顯著性（P<0.05），且平均明視持久度提高大于等于10%。

具備4.3.1及4.3.2可判定該受試物具有緩解視覺疲勞功能。

5 清咽潤喉功能

5.1 試驗項目

5.1.1 動物實驗

5.1.1.1 體重

5.1.1.2 大鼠棉球植入實驗

5.1.1.3 大鼠足趾腫脹實驗

5.1.1.4 小鼠耳腫脹實驗

5.1.2 人體試食試驗：咽部癥狀、體征

5.2 試驗原則

5.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

5.2.2 應對臨床癥狀、體征進行觀察。

5.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

5.3 結果判定

5.3.1 動物實驗：大鼠棉球植入實驗結果陽性，同時大鼠足趾腫脹實驗或小鼠耳腫脹實驗結果任意一項陽性，可判定該受試樣品清咽功能動物實驗結果為陽性。

5.3.2 人體試食試驗：試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，咽部癥狀及體征有明顯改善，癥狀及體征的改善率明顯增加，可判定該受試樣品具有清咽潤喉功能。

6 有助于改善睡眠功能

6.1 試驗項目

6.1.1 體重

6.1.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

6.1.3 戊巴比妥鈉（或巴比妥鈉）閾下劑量催眠實驗

6.1.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

6.2 試驗原則

6.2.1 所列指標均為必做項目。

6.2.2 需觀察受試樣品對動物直接睡眠的作用。

6.3 結果判定

延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉（或巴比妥鈉）閾下劑量催眠實驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗三項實驗中任二項陽性，且無明顯直接睡眠作用，可判定該受試樣品具有有助于改善睡眠功能的作用。

7 緩解體力疲勞功能

7.1 實驗項目

7.1.1 動物體重

7.1.2 負重游泳實驗

7.1.3 血乳酸

7.1.4 血清尿素

7.1.5 肝糖原或肌糖原

7.2 試驗原則

7.2.1 動物實驗所列指標均為必做項目。

7.2.2 實驗前必須對同批受試樣品進行違禁藥物的檢測。

7.2.3 運動實驗與生化指標檢測相結合。

7.3 結果判定

負重游泳實驗結果陽性，血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元三項生化指標中任二項指標陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。

8 耐缺氧功能

8.1 試驗項目

8.1.1 體重

8.1.2 常壓耐缺氧實驗

8.1.3 亞硝酸鈉中毒存活實驗

8.1.4 急性腦缺血性缺氧實驗

8.2 試驗原則

所列指標均為必做項目。

8.3 結果判定

常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗、急性腦缺血性缺氧實驗三項實驗中任二項實驗結果陽性，可判定該受試樣品具有耐缺氧功能的作用。

9 有助于調節體內脂肪功能

9.1 試驗項目

9.1.1 動物實驗

9.1.1.1 體重、體重增重

9.1.1.2 攝食量、攝入總熱量

9.1.1.3 體內脂肪重量（睪丸及腎周圍脂肪墊）

9.1.1.4 脂/體比

9.1.2 人體試食試驗

9.1.2.1 體重

9.1.2.2 腰圍、臀圍

9.1.2.3 體內脂肪含量

9.2 試驗原則

9.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

9.2.2 動物實驗中大鼠肥胖模型法和預防大鼠肥胖模型法任選其一。

9.2.3 減少體內多余脂肪，不單純以減輕體重為目標。

9.2.4 引起腹瀉或抑制食欲的受試樣品不能作為有助于調節體內脂肪功能食品。

9.2.5 每日營養素攝入量應基本保證機體正常生命活動的需要。

9.2.6 對機體健康無明顯損害。

9.2.7 實驗前應對同批受試樣品進行違禁藥物的檢測。

9.2.8 以各種營養素為主要成分替代主食的有助于調節體內脂肪功能食品可以不進行動物實驗，僅進行人體試食試驗。

9.2.9 不替代主食的有助于調節體內脂肪功能試驗，應對試食前后的受試者膳食和運動狀況進行觀察。

9.2.10 替代主食的有助于調節體內脂肪功能試驗，除開展不替代主食的設計指標外，還應設立身體活動、情緒、工作能力等測量表格，排除服用受試樣品后無相應的負面影響產生。結合替代主食的受試樣品配方，對每日膳食進行營養學評估。

9.2.11 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

9.3 結果判定

9.3.1 動物實驗：實驗組的體重或體重增重低于模型對照組，體內脂肪含量或脂/體比低于模型對照組，差異有顯著性，攝食量不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品動物有助于調節體內脂肪功能實驗結果陽性。

9.3.2 人體試食試驗：

不替代主食的有助于調節體內脂肪功能受試樣品：試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，體內脂肪重量減少，皮下脂肪四個點中任兩個點減少，腰圍與臀圍之一減少，且差異有顯著性，運動耐力不下降，對機體健康無明顯損害，并排除膳食及運動對有助于調節體內脂肪功能作用的影響，可判定該受試樣品具有有助于調節體內脂肪功能的作用。

替代主食的有助于調節體內脂肪功能受試樣品：試食組試驗前后自身比較，其體內脂肪含量減少，皮下脂肪四個點中至少有兩個點減少，腰圍與臀圍之一減少，且差異有顯著性（P<0.05），微量元素、維生素營養學評價無異常，運動耐力不下降，情緒、工作能力不受影響，并排除運動對有助于調節體內脂肪功能作用的影響，可判定該受試樣品具有有助于調節體內脂肪功能的作用。

10 有助于改善骨密度功能

10.1 試驗項目

動物實驗：分為方案一（補鈣為主的受試物）和方案二（不含鈣或不以補鈣為主的受試物）兩種。

10.1.1 體重

10.1.2 骨鈣含量

10.1.3 骨密度

10.2 試驗原則

10.2.1 根據受試樣品作用原理的不同，方案一和方案二任選其一進行動物實驗。

10.2.2 所列指標均為必做項目。

10.2.3 使用未批準用于食品的鈣的化合物，除必做項目外，還必須進行鈣吸收率的測定；使用屬營養強化劑范圍內的鈣源及來自普通食品的鈣源（如可食動物的骨、奶等），可以不進行鈣的吸收率實驗。

10.3 結果判定

方案一

骨鈣含量或骨密度顯著高于低鈣對照組且不低于相應劑量的碳酸鈣對照組，鈣的吸收率不低于碳酸鈣對照組，可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。

方案二

不含鈣的產品，骨鈣含量或骨密度較模型對照組明顯增加，且差異有顯著性，可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。

不以補鈣為主（可少量含鈣）的產品，骨鈣含量或骨密度較模型對照組明顯增加，差異有顯著性，且不低于相應劑量的碳酸鈣對照組，鈣的吸收率不低于碳酸鈣對照組，可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。

11 改善缺鐵性貧血功能

11.1 試驗項目

11.1.1 動物實驗

11.1.1.1 體重

11.1.1.2 血紅蛋白

11.1.1.3 紅細胞壓積/紅細胞游離原卟啉

11.1.2 人體試食試驗

11.1.2.1 血紅蛋白

11.1.2.2 血清鐵蛋白

11.1.2.3 紅細胞內游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度

11.2 試驗原則

11.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

11.2.2 針對兒童的人體試食試驗，只測血紅蛋白和紅細胞內游離原卟啉。

11.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

11.3 結果判定

11.3.1 動物實驗：血紅蛋白指標陽性，紅細胞內游離原卟啉/紅細胞壓積二項指標一項指標陽性，可判定該受試樣品改善缺鐵性貧血功能動物實驗結果為陽性。

11.3.2 人體試食試驗

11.3.2.1 針對改善兒童缺鐵性貧血功能的，血紅蛋白和紅細胞內游離原卟啉二項指標陽性，可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血功能作用。

11.3.2.2 針對改善成人缺鐵性貧血功能的，血紅蛋白指標陽性，血清鐵蛋白、紅細胞內游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度二項指標一項指標陽性，可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血功能作用。

12 有助于改善痤瘡功能

12.1 人體試食試驗項目

12.1.1 痤瘡數量

12.1.2 皮損狀況

12.1.3 皮膚油份

12.2 試驗原則

12.2.1 所列的指標均為必做項目。

12.2.2 試驗前后應針對固定皮膚范圍內的痤瘡數量及皮損狀況進行分析。

12.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

12.3 結果判定

試食組痤瘡數量明顯減少且大于等于20％，皮損程度積分明顯減少，差異均有顯著性，皮膚油份不顯著增加，可判定該受試樣品具有有助于改善痤瘡功能的作用。

13 有助于改善黃褐斑功能

13.1 人體試食試驗項目

13.1.1 黃褐斑面積

13.1.2 黃褐斑顏色

13.2 試驗原則

13.2.1 所列的指標均為必做項目。

13.2.2 試驗前后應針對固定皮膚范圍內的黃褐斑面積及顏色進行分析。

13.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

13.3 結果判定

試食組黃褐斑面積明顯減少且大于等于10%，顏色積分明顯下降，差異均有顯著性，且不產生新的黃褐斑，可判定該受試樣品具有有助于改善黃褐斑功能的作用。

14 有助于改善皮膚水份狀況功能

14.1 人體試食試驗項目：皮膚水份

14.2 試驗原則

14.2.1 皮膚水份值的測定點試驗前后應保持一致。

14.2.2 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

14.3 結果判定：試食組皮膚水份明顯改善，差異有顯著性，可判定該受試樣品具有有助于改善皮膚水分狀況功能的作用。

15 有助于調節腸道菌群功能

15.1 試驗項目

15.1.1 動物實驗

15.1.1.1 體重

15.1.1.2 雙歧桿菌

15.1.1.3 乳桿菌

15.1.1.4 腸球菌

15.1.1.5 腸桿菌

15.1.1.6 產氣莢膜梭菌

15.1.2 人體試食試驗

15.1.2.1 雙歧桿菌

15.1.2.2 乳桿菌

15.1.2.3 腸球菌

15.1.2.4 腸桿菌

15.1.2.5 擬桿菌

15.1.2.6 產氣莢膜梭菌

15.2 試驗原則

15.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

15.2.2 正常動物或腸道菌群紊亂模型動物任選其一。

15.2.3 受試樣品中含雙歧桿菌、乳桿菌以外的其它益生菌時，應在動物和人體試驗中加測該益生菌。

15.2.4 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

15.3 結果判定

15.3.1 動物實驗：符合以下任一項，可判定該受試樣品有助于調節腸道菌群功能動物實驗結果陽性。

15.3.1.1 雙歧桿菌和/或乳桿菌（或其它益生菌）明顯增加，梭菌減少或無明顯變化，腸球菌、腸桿菌無明顯變化。

15.3.1.2 雙歧桿菌和/或乳桿菌（或其它益生菌）明顯增加，梭菌減少或無明顯變化，腸球菌和/或腸桿菌明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌（或其它益生菌）增加的幅度。

15.3.2 人體試食試驗：符合以下任一項，可判定該受試樣品具有有助于調節腸道菌群功能的作用。

15.3.2.1 雙歧桿菌和/或乳桿菌（或其它益生菌）明顯增加，梭菌減少或無明顯變化，腸球菌、腸桿菌、擬桿菌無明顯變化。

15.3.2.2 雙歧桿菌和/或乳桿菌（或其它益生菌）明顯增加，梭菌減少或無明顯變化，腸球菌和/或腸桿菌、擬桿菌明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌（或其它益生菌）增加的幅度。

16 有助于消化功能

16.1 試驗項目

16.1.1 動物實驗

16.1.1.1 體重、體重增重、攝食量和食物利用率

16.1.1.2 小腸運動實驗

16.1.1.3 消化酶測定

16.1.2 人體試食試驗

16.1.2.1 兒童方案

16.1.2.1.1 食欲

16.1.2.1.2 食量

16.1.2.1.3 偏食狀況

16.1.2.1.4 體重

16.1.2.1.5 血紅蛋白含量

16.1.2.2 成人方案

16.1.2.2.1 臨床癥狀觀察

16.1.2.2.2 胃/腸運動實驗

16.2 試驗原則

16.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

16.2.2 根據受試樣品的適用人群特點在人體試食試驗方案中任選其一。

16.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

16.3 結果判定

16.3.1 動物實驗：動物體重、體重增重、攝食量、食物利用率，小腸運動實驗和消化酶測定三方面中任二方面實驗結果陽性，可判定該受試樣品有助于消化功能動物實驗結果陽性。

16.3.2 人體試食試驗

16.3.2.1 針對改善兒童消化功能的，食欲、進食量、偏食改善結果陽性，體重和血紅蛋白二項指標中任一項指標結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于消化功能的作用。

16.3.2.2 針對改善成人消化功能的，臨床癥狀明顯改善，胃/腸運動實驗結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于消化功能的作用。

17 有助于潤腸通便功能

17.1 試驗項目

17.1.1 動物實驗

17.1.1.1 體重

17.1.1.2 小腸運動實驗

17.1.1.3 排便時間

17.1.1.4 糞便重量

17.1.1.5 糞便粒數

17.1.1.6 糞便性狀

17.1.2 人體試食試驗

17.1.2.1 癥狀體征

17.1.2.2 糞便性狀

17.1.2.3 排便次數

17.1.2.4 排便狀況

17.2 試驗原則

17.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

17.2.2 除對便秘模型動物各項必測指標進行觀察外，還應對正常動物進行觀察，不得引起動物明顯腹瀉。

17.2.3 排便次數的觀察時間試驗前后應保持一致。

17.2.4 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

17.3 結果判定

17.3.1 動物實驗：排糞便重量和糞便粒數一項結果陽性，同時小腸運動實驗和排便時間一項結果陽性，可判定該受試樣品有助于通便功能動物實驗結果陽性。

17.3.2 人體試食試驗：排便次數明顯增加，同時糞便性狀和排便狀況一項結果明顯改善，可判定該受試樣品具有有助于潤腸通便功能的作用。

18 輔助保護胃粘膜功能

18.1 試驗項目

18.1.1 動物實驗

18.1.1.1 體重

18.1.1.2 胃粘膜損傷大體觀察

18.1.1.3 胃粘膜組織病理學檢查

18.1.2 人體試食試驗

18.1.2.1 臨床癥狀

18.1.2.2 體征

18.1.2.3 胃鏡觀察

18.2 試驗原則

18.2.1 動物實驗的體重和胃粘膜損傷大體觀察為必做項目，胃粘膜組織病理學檢查為選做項目；人體試食試驗所列指標均為必做項目。

18.2.2 無水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜損傷模型或冰醋酸致慢性胃潰瘍模型任選其一進行動物實驗。

18.2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的安全性作進一步的觀察。

18.3 結果判定

18.3.1 動物實驗：實驗組與模型對照組比較，胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動物實驗結果為陽性。

18.3.2 人體試食試驗：試食組與對照組比較，臨床癥狀、體征積分明顯減少，胃鏡復查結果有改善或不加重，可判定該受試樣品具有輔助保護胃粘膜功能的作用。

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根據血脂異常的類型，有助于維持血脂健康水平（膽固醇/甘油三酯）功能按照不同的血脂異常分型設立分類的動物實驗和人體試食試驗。

19.1 試驗項目

19.1.1 根據受試樣品的作用機制，分成三種情況

19.1.1.1 有助于維持血脂健康水平功能：同時維持血總膽固醇和血甘油三酯健康水平

19.1.1.2 有助于維持血膽固醇健康水平功能：單純維持血膽固醇健康水平

19.1.1.3 有助于維持血甘油三酯健康水平功能：單純維持血甘油三酯健康水平

19.1.2 觀察指標

19.1.2.1 體重

19.1.2.2 血清總膽固醇

19.1.2.3 血清甘油三酯

19.1.2.4 血清高密度脂蛋白膽固醇

19.1.2.5 血清低密度脂蛋白膽固醇

19.1.3 人體試食試驗

19.1.3.1 血清總膽固醇

19.1.3.2 血清甘油三酯

19.1.3.3 血清高密度脂蛋白膽固醇

19.1.3.4 血清低密度脂蛋白膽固醇

19.2 試驗原則

19.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必測項目。

19.2.2 根據受試樣品的作用機制，可在動物實驗的兩個動物模型中任選一項。

19.2.3 根據受試樣品的作用機制，可在人體試食試驗的三個方案中任選一項。

19.2.4 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

19.3 結果判定

19.3.1 動物實驗：

19.3.1.1 混合型高脂血癥動物模型

有助于維持血脂健康水平（膽固醇/甘油三酯）功能結果判定：模型對照組和空白對照組比較，血清甘油三酯升高，血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高，差異均有顯著性，判定模型成立。（1）各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，且任一劑量組血清甘油三酯降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平動物實驗結果陽性。（2）各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清甘油三酯不顯著高于模型對照組，各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動物實驗結果陽性。（3）各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清甘油三酯降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇不顯著高于模型對照組，血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血甘油三酯健康水平功能動物實驗結果陽性。

19.3.1.2 高膽固醇血癥動物模型

模型對照組和空白對照組比較，血清總膽固醇（TC）或低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，差異有顯著性，血清甘油三酯（TG）差異無顯著性，判定模型成立。各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，差異有顯著性，并且各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）不顯著低于模型對照組，血清甘油三酯不顯著高于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動物實驗結果陽性。

19.3.2 人體試食試驗

指標判定標準：

有效：TC 降低>10%或降至正常；TG 降低>15%或降至正常；HDL-C 上升>0.104mmol/L。

無效：未達到有效標準者。

19.3.2.1有助于維持血脂健康水平（膽固醇/甘油三酯）功能結果判定

試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，受試者血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇降低，差異均有顯著性，同時血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于對照組，試驗組總有效率顯著高于對照組，可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平（膽固醇/甘油三酯）人體試食試驗結果陽性。

19.3.2.2 有助于維持血膽固醇健康水平功能結果判定

試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，受試者血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇降低，差異有顯著性，同時血清甘油三酯不顯著高于對照組，血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于對照組，試驗組血清總膽固醇有效率顯著高于對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能人體試食試驗結果陽性。

19.3.2.3 有助于維持血甘油三酯健康水平功能結果判定

試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，受試者血清甘油三酯降低，差異有顯著性，同時血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇不顯著高于對照組，血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于對照組，試驗組血清甘油三酯有效率顯著高于對照組，可判定該受試樣品有助于維持血甘油三酯健康水平功能人體試食試驗結果陽性。

20有助于維持血糖健康水平功能

20.1 試驗項目

20.1.1 動物實驗

分為方案一（胰島損傷高血糖模型）和方案二（胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型）兩種

20.1.1.1 方案一（胰島損傷高血糖模型）

20.1.1.1.1 體重

20.1.1.1.2 空腹血糖

20.1.1.1.3 糖耐量

20.1.1.2 方案二（胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型）

20.1.1.2.1 體重

20.1.1.2.2 空腹血糖

20.1.1.2.3 糖耐量

20.1.1.2.4 胰島素

20.1.1.2.5 總膽固醇

20.1.1.2.6 甘油三酯

20.1.2 人體試食試驗

20.1.2.1 空腹血糖

20.1.2.2 餐后2小時血糖

20.1.2.3 糖化血紅蛋白（HbA1c）或糖化血清蛋白

20.1.2.4 總膽固醇

20.1.2.5 甘油三酯

20.2 試驗原則

20.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

20.2.2 根據受試樣品作用原理不同，方案一和方案二動物模型任選其一進行動物實驗。

20.2.3 除對高血糖模型動物進行所列指標的檢測外，應進行受試樣品對正常動物空腹血糖影響的觀察。

20.2.4 人體試食試驗可在臨床治療的基礎上進行。

20.2.5 應對臨床癥狀和體征進行觀察。

20.2.6 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

20.3 結果判定

20.3.1 動物實驗：

方案一：空腹血糖和糖耐量二項指標中一項指標陽性，且對正常動物空腹血糖無影響，即可判定該受試樣品有助于維持血糖健康水平動物實驗結果陽性。

方案二：空腹血糖和糖耐量二項指標中一項指標陽性，血脂（總膽固醇、甘油三酯）無明顯升高，且對正常動物空腹血糖無影響，即可判定該受試樣品有助于維持血糖健康水平功能動物實驗結果陽性。

20.3.2 人體試食試驗：空腹血糖、餐后2小時血糖、糖化血紅蛋白（或糖化血清蛋白）、血脂四項指標均無顯著升高，且空腹血糖、餐后2小時血糖兩項指標中一項指標陽性，對機體健康無不利影響，可判定該受試樣品具有有助于維持血糖健康水平功能的作用。

21有助于維持血壓健康水平功能

21.1 試驗項目

21.1.1 動物實驗

21.1.1.1 體重

21.1.1.2 血壓

21.1.1.3 心率

21.1.2 人體試食試驗

21.1.2.1 臨床癥狀與體征

21.1.2.2 血壓

21.1.2.3 心率

21.2 試驗原則

21.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

21.2.2 動物實驗應選擇高血壓模型動物和正常動物進行所列指標的觀察。

21.2.3 人體試食試驗可在臨床治療的基礎上進行。

21.2.4 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

21.3 結果判定

21.3.1 動物實驗：實驗組動物血壓明顯低于對照組，且對實驗組動物心率和正常動物血壓及心率無影響，可判定該受試樣品有助于維持血壓健康水平功能動物實驗結果陽性。

21.3.2 人體試食試驗：舒張壓或收縮壓二項指標中任一指標結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于維持血壓健康水平功能的作用。

22 對化學性肝損傷有輔助保護功能

22.1 試驗項目

動物實驗分為方案一（四氯化碳肝損傷模型）和方案二（酒精肝損傷模型）兩種。

22.1.1 方案一（四氯化碳肝損傷模型）

22.1.1.1 體重

22.1.1.2 谷丙轉氨酶（ALT）

22.1.1.3 谷草轉氨酶（AST）

22.1.1.4 肝組織病理學檢查

22.1.2方案二（酒精肝損傷模型）

22.1.2.1 體重

22.1.2.2 丙二醛（MDA）

22.1.2.3 還原型谷胱甘肽（GSH）

22.1.2.4 甘油三酯（TG）

22.1.2.5 肝組織病理學檢查

22.2 試驗原則

22.2.1 所列指標均為必做項目。

22.2.2 根據受試樣品作用原理的不同，方案一和方案二任選其一進行動物實驗。

22.3 結果判定

方案一（四氯化碳肝損傷模型）：病理結果陽性，谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶二指標中任一項指標陽性，可判定該受試樣品具有對化學性肝損傷有輔助保護功能作用。

方案二（酒精肝損傷模型）：①肝臟MDA、GSH、TG三項指標結果陽性，可判定該受試樣品對乙醇引起的肝損傷有輔助保護功能，②肝臟MDA、GSH、TG三指標中任二項指標陽性，且肝臟病理結果陽性，可判定該受試樣品具有對乙醇引起的肝損傷有輔助保護功能作用。

23對電離輻射危害有輔助保護功能

23.1 實驗項目

23.1.1 體重

23.1.2 外周血白細胞計數

23.1.3 骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數

23.1.4 小鼠骨髓細胞微核實驗

23.1.5 血／組織中超氧化物歧化酶活性實驗

23.1.6 血清溶血素含量實驗

23.2 實驗原則

外周血白細胞計數、骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數、小鼠骨髓細胞微核實驗、血／組織中超氧化物歧化酶活性實驗、血清溶血素含量實驗中任選擇三項進行實驗。

23.3 結果判定

在外周血白細胞計數、骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數、小鼠骨髓細胞微核、血／組織中超氧化物歧化酶活性、血清溶血素含量五項實驗中任何二項實驗結果陽性，可判定該受試樣品具有對電離輻射危害有輔助保護功能的作用。

24 有助于排鉛功能

24.1 試驗項目

24.1.1 動物實驗

24.1.1.1 體重

24.1.1.2 血鉛

24.1.1.3 骨鉛

24.1.1.4 肝組織鉛

24.1.2 人體試食試驗

24.1.2.1 血鉛

24.1.2.2 尿鉛

24.1.2.3 尿鈣

24.1.2.4 尿鋅

24.2 試驗原則

24.2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

24.2.2 應對臨床癥狀、體征進行觀察。

24.2.3 對尿鉛進行多次測定，以了解體內鉛的排出情況。

24.2.4 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

24.3 結果判定

24.3.1 動物實驗：實驗組與模型對照組比較，骨鉛含量顯著降低，同時血鉛或肝鉛含量顯著降低，可判定該受試樣品動物實驗結果為陽性。

24.3.2 人體試食試驗：試食組與對照組組間比較，至少兩個觀察時點尿鉛排出量增加且顯著高于試驗前，或總尿鉛排出量明顯增加。同時，對總尿鈣、總尿鋅的排出無明顯影響，或總尿鈣、總尿鋅排出增加的幅度小于總尿鉛排出增加的幅度，可判定該受試樣品具有有助于排鉛功能的作用。

第二部分 功能學檢驗方法

一、有助于增強免疫力功能檢驗方法

1. 實驗動物

推薦用近交系小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。

2. 劑量分組及受試樣品給予時間

實驗設三個劑量組和一個陰性對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設二個劑量組，必要時設陽性對照組。

受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。免疫模型動物實驗時間可適當延長。

3. 實驗方法

3.1 ConA 誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗

可任選下列方法之一

3.1.1 MTT法

3.1.1.1 原理

當T淋巴細胞受ConA刺激后發生母細胞發生增殖反應，活細胞特別是增殖細胞中的線粒體水解酶可將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結晶，其光密度值能反映細胞的增殖情況。

3.1.1.2 儀器和材料

RPMI1640細胞培養液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、鹽酸、異丙醇、MTT、Hank's液、PBS緩沖液（pH7.2-7.4）

紗布或200目篩網、24孔培養板，96孔培養板（平底），手術器械、二氧化碳培養箱、酶標儀、721分光光度計、超凈工作臺、高壓滅菌器、無菌濾器。

3.1.1.3 實驗步驟

3.1.1.3.1 試劑配制

完全培養液 RPMI1640培養液過濾除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），鏈霉素（100μg/L）及5×10－5mol/L的2-巰基乙醇，用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH調pH至7.0-7.2，即完全培養液。

ConA液 用雙蒸水配制成100μg/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（-20℃）保存。

無菌Hank's液 用前以3.5%的無菌NaHCO3調pH至7.2-7.4。

MTT液 將5mg MTT溶于1mL pH7.2的PBS中，現配現用。

酸性異丙醇溶液 96mL 異丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，臨用前配制。

3.1.1.3.2 脾細胞懸液制備

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經200目篩網過濾，或用4層紗布將脾磨碎，用Hank's液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于1mL的完全培養液中，用臺酚蘭染色計數活細胞數（應在95%以上），調整細胞濃度為3×106個/mL。

3.1.1.3.3 淋巴細胞增殖反應

將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA 液（相當于7.5μg/mL），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培養72h。培養結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養液，同時加入MTT（5mg/mL）50μL /孔，繼續培養4h。培養結束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板中，每個孔作3個平行孔，用酶標儀，以570nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度計上在波長570nm測定OD值。

3.1.1.4 數據處理及結果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值

用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結果陽性。

3.1.1.5 注意事項

本實驗中ConA的濃度很重要，過低不能刺激足夠的細胞增殖，過高會抑制細胞增殖，不同批號的ConA在實驗前要進行預試，以找到最佳濃度。

3.1.2 同位素摻入法

3.1.2.1 原理

T淋巴細胞在有絲分裂原PHA、ConA 等的刺激下，產生增殖反應，DNA和RNA合成明顯增加，如在培養液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），則可被轉化中的細胞攝入。測定標記淋巴細胞的放射強度可反映淋巴細胞增殖的程度。

3.1.2.2 儀器和材料

RPMI-1640 細胞培養液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、3H-TdR、閃爍液[2,5-二苯基惡唑（PPO）0.5g、1,4-雙-（5-苯基惡唑基）-苯（POPOP）0.25g、二甲苯500mL混勻]

200目篩網，96孔培養板（平底），手術器械、二氧化碳培養箱、超凈工作臺、液體閃爍儀、多頭細胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。

3.1.2.3 實驗步驟

3.1.2.3.1 脾細胞懸液制備

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細胞懸液。經200目篩網過濾，用Hank's液洗3次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于2mL的完全培養液中，用臺酚蘭染色計數活細胞數（應在95%以上），最后用RPMI1640完全培養液將細胞數調成5×106個/mL。

3.1.2.3.2 淋巴細胞增殖反應

將脾細胞懸液加入到96孔培養板中，200μL/孔，每一份脾細胞懸液分裝6個孔，3孔加ConA（5μg/mL），另3個孔不加ConA作為對照。置5% CO2，37℃培養72h，培養結束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多頭細胞收集器將細胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數（cpm）。

3.1.2.4 數據處理及結果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值

以每分鐘脈沖數（cpm）表示增殖程度，用刺激指數（SI）來表示

SI=

受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值，即可判定該項實驗結果陽性。

3.2 遲發型變態反應（DTH）

可任選下列方法之一

3.2.1 二硝基氟苯誘導小鼠DTH（耳腫脹法）

3.2.1.1 原理

二硝基氟苯（DNFB）稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。4～7天后再將其涂抹于耳部進行抗原攻擊，使局部腫脹，一般在抗原攻擊后24～48h達高峰，其腫脹程度可以反應映遲發型變態反應程度。

3.2.1.2 材料

DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器。

3.2.1.3 實驗步驟

3.2.1.3.1 試劑配制

DNFB溶液 DNFB溶液應新鮮配制，稱取DNFB50mg，置清潔干燥小瓶中，將預先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封。混勻后，用250μL注射器通過瓶蓋取用。

3.2.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛或剃毛，范圍約 3cm×3cm，用 DNFB 溶液50μL均勻涂抹致敏。

3.2.1.3.3 DTH的產生與測定 5天后，用DNFB溶液10μL均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。攻擊后 24h 頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。

3.2.1.4 數據處理與結果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值

用左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值，可判定該項實驗結果陽性。

3.2.1.5 注意事項

操作時應避免DNFB與皮膚接觸。

3.2.2 綿羊紅細胞（SRBC）誘導小鼠DTH（足跖增厚法）

3.2.2.1 原理

SRBC可刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，4天后，當再以SRBC攻擊時，攻擊部位出現腫脹，其腫脹程度可反映遲發型變態反應程度。

3.2.2.2 材料

游標卡尺（精密度0.02mm）、SRBC、微量注射器（50μL）。

3.2.2.3 實驗步驟

3.2.2.3.1 致敏 小鼠用2%（v/v）SRBC腹腔或靜脈免疫，每只鼠注射0.2mL（約1×108個SRBC）。

3.2.2.3.2 DTH的產生與測定 免疫后4天，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%（v/v）SRBC，每只鼠20μL（約1×108個SRBC），注射后于24h測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。

3.2.2.4 數據處理和結果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值

以攻擊前后足跖厚度的差值來表示DTH的程度。受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值，可判定該項實驗結果陽性。

3.2.2.5 注意事項

測量足跖厚度時，最好由專人來進行。卡尺緊貼足跖部，但不要加壓，否則會影響測量結果。

攻擊時所用的SRBC要新鮮（4℃保存期不超過1周）。

3.3 抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）

3.3.1 原理

經過綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的SRBC混合，在補體參與下，使分泌抗體的脾細胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑。溶血空斑數可反映抗體生成細胞數。

3.3.2 儀器和材料

二氧化碳培養箱、恒溫水浴、離心機、手術器械、玻片架、200目篩網、SRBC、補體（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培養液、SA緩沖液、瓊脂糖。

3.3.3 實驗步驟

3.3.3.1 SRBC 綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存備用，可保存2周。

3.3.3.2 制備補體 采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清），將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，經常振蕩，離心取上清，分裝，－70℃保存。用時以SA緩沖液按1：8－15稀釋。

3.3.3.3 玻片涂膜 在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂糖（0.5g瓊脂糖加雙蒸水至100mL，加熱溶解），干后可長期保存備用。

3.3.3.4 免疫動物 取脫纖維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min，計數細胞，每只鼠經腹腔或靜脈注射SRBC 5×107～2×108個。也可將壓積SRBC 用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL。

3.3.3.5 脾細胞懸液制備

將SRBC免疫4～5天后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有Hank's液的小平皿內，輕輕磨碎脾臟，制成細胞懸液，經200目篩網過濾，或用4層紗布將脾磨碎，離心（1000r/min）10min，用Hank's液洗2遍，最后將細胞懸浮在5mL RPMI1640培養液中，計數細胞，并將細胞濃度調整為5x106個/mL。也可將細胞懸浮在8mL Hank's液。

3.3.3.6 空斑的測定

將表層培養基（1g瓊脂糖加雙蒸水至100mL）加熱溶解后，放45～50℃水浴保溫，與等量pH7.2～7.4、2倍濃度的Hank's液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內加50μL 10% SRBC（v/v，用SA緩沖液配制），20μL脾細胞懸液（5×106個/mL）或25μL脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養箱中孵育1～1.5h，然后用SA緩沖液稀釋的補體（1：8）加入到玻片架凹槽內，繼續溫育1～1.5h后，計數溶血空斑數。

3.3.4 數據處理及結果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值

用空斑數/105脾細胞或空斑數/全脾細胞來表示，受試樣品組的空斑數顯著高于對照組的空斑數，可判定該項實驗結果陽性。

3.4 血清溶血素的測定

可任選下列方法之一。

3.4.1 血凝法

3.4.1.1 原理

用SRBC免疫動物后，產生抗SRBC抗體（溶血素），利用其凝集SRBC的程度來檢測溶血素的水平。

3.4.1.2 儀器和材料

SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機

3.4.1.3 實驗步驟

3.4.1.3.1 SRBC 綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存備用，可保存2周。

3.4.1.3.2 免疫動物及血清分離 取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于離心管內，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。

3.4.1.3.3 凝集反應 用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內，每孔100μL，再加入100μL 0.5%（v/v）的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。

3.4.1.4 數據處理及結果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值

血清凝集程度一般分為5級（0－IV）記錄，按下式計算抗體積數，受試樣品組的抗體積數顯著高于對照組的抗體水平，可判定該項實驗結果陽性。

抗體水平＝（S1+2S2+3S3……nSn）

式中1、2、3……n代表對倍稀釋的指數，S代表凝集程度的級別，抗體積數越大，表示血清抗體越高。

0級 紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。

I級 紅細胞大部分沉集在孔底成園點狀，四周有少量凝集的紅細胞。

II級 凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。

III級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。

IV級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

3.4.1.5 注意事項

血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應不出現凝集現象。

3.4.2 半數溶血值（HC50）的測定

3.4.2.1 原理

用SRBC免疫動物后，血清中出現SRBC抗體（溶血素），在補體參與下，與SRBC一起孵育，可發生溶血反應，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。

3.4.2.2 儀器和材料

721分光光度計、離心機、恒溫水浴、SRBC、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g，加蒸餾水至1000mL）

3.4.2.3 實驗步驟

3.4.2.3.1 SRBC 綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存備用，可保存2周。

3.4.2.3.2 制備補體 采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清），將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，經常振蕩，離心取上清，分裝，－70℃保存。用時以SA液按1：8稀釋。

3.4.2.3.3 免疫動物及血清分離 取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2％（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于離心管內，放置約1h，使血清充分析出，2000r/min離心10min，或6000r/min，4min，收集血清。

3.4.2.3.4 溶血反應

3.4.2.3.4.1 分光光度計法 取血清用SA緩沖液稀釋（一般為200～500倍）。將稀釋后的血清1mL置試管內，依次加入10%（v/v）SRBC 0.5mL，補體1mL（用SA液按1:8稀釋）。另設不加血清的對照管（以SA緩沖液代替）。置37℃恒溫水浴中保溫15～30min后，冰浴終止反應。2000r/min離心10min。取上清液1mL，加都氏試劑3mL，同時取10%（v/v）SRBC 0.25mL加都氏試劑至4mL，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。

3.4.2.3.4.2 酶標儀法 設樣品孔和空白對照孔，樣品孔：取血清用SA緩沖液稀釋（一般200～500倍）；每孔加入稀釋后的血清50μL；空白對照孔：每孔加入50μLSA緩沖液，再依次加入10%（v/v）SRBC 25μL，補體50μL（用SA溶液按1:8稀釋），置37℃恒溫培養箱中保溫30min，冰浴終止反應，1500r/min水平離心10min，然后樣品孔和空白對照孔各取上清液50μL加入另一個96孔培養板內，加都氏試劑150μL。同時設半數溶血孔，加入10%（v/v）SRBC 12.5μL再加都氏試劑至200μL。用震蕩器充分混勻，放置10min后，于540nm處用全自動酶標儀測定各孔光密度值。