【CMDE】關于公開征求《重組人源化膠原蛋白原材料評價指導原則（征求意見稿）》意見的通知

各有關單位：

　　根據國家藥品監督管理局2022年度醫療器械注冊審查指導原則制修訂計劃的有關要求，我中心組織編制了《重組人源化膠原蛋白原材料評價指導原則》，經調研、討論，現已形成征求意見稿（附件1），即日起在網上公開征求意見。根據《重組膠原蛋白生物材料命名指導原則》等規范性文件的相關情況，本指導原則將適時做出調整。

　　如有意見和建議，請填寫意見反饋表（附件2），以電子郵件的形式于2022年12月2日前反饋至我中心。郵件主題及文件名稱請以“《重組人源化膠原蛋白原材料評價指導原則（征求意見稿）》意見反饋+反饋單位名稱”格式命名。

　　聯系人：郭曉磊，劉文博

　　聯系方式：010-86452815；010-86452675

　　電子郵箱：guoxl@cmde.org.cn；liuwb@cmde.org.cn

　　附件：1.重組人源化膠原蛋白原材料評價注冊審查指導原則（征求意見稿）（下載）

　　　　　2. 意見反饋表（下載）

國家藥品監督管理局  

醫療器械技術審評中心

2022年11月7日    

【附件1】

重組人源化膠原蛋白原材料評價指導原則（征求意見稿）

本指導原則旨在指導注冊申請人對植入類醫療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進行充分的研究，并整理形成產品注冊申報資料，同時也為技術審評部門對重組人源化膠原蛋白制成的產品注冊申報資料包括所引用主文檔內容的技術審評提供參考。本指導原則主要針對植入類醫療器械的重組人源化膠原蛋白原材料的評價，其它醫療器械用重組膠原蛋白原材料的評價也可以參考本指導原則適用的部分。

本指導原則系對醫療器械用重組人源化膠原蛋白原材料的一般要求，適用于人膠原蛋白的所有型別，注冊申請人需依據具體醫療器械產品的特性對產品注冊申報資料涉及的原材料相關內容進行充實和細化，并依據產品的具體特性確定本指導原則相關內容的適用性。本指導原則不直接涉及重組人源化膠原蛋白材料制成的醫療器械終產品的安全性或有效性評價，具體產品的評價請參考相應的產品注冊審查指導原則。

本指導原則是對注冊申請人和技術審評人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料；需在遵循相關法規和強制性標準的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將進行適時的調整。

一、前言

近年來，隨著基因重組、蛋白質組學等基礎理論、技術手段和臨床醫療探索研究的不斷發展，重組膠原蛋白日益成為重要的生物材料，為相關醫療器械的研發提供了新的思路與方法。重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。

重組人源化膠原蛋白僅是重組膠原蛋白的一類，材料特性并不能完全決定最終產品的安全性和有效性。本指導原則中的“原材料”是指用于生產制造醫療器械用的重組人源化膠原蛋白材料。

重組人源化膠原蛋白是通過基因工程生產的蛋白，工程細胞構建過程、生產用細胞的質量控制及常規生產過程控制是該原材料生產工藝及風險評價的基礎，此方面主要的驗證資料，可參考本指導原則的資料性附錄作為材料生物安全性研究資料的補充，但不作為產品注冊申報資料或主文檔的必要內容。結合重組人源化膠原蛋白的特點，該附錄修改引用了國家藥監局藥審中心《重組制品生產用哺乳動物細胞質量控制技術評價一般原則》、《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則》等生物制品指導原則的相關內容。

二、評價要點

（一） 重組人源化膠原蛋白原材料性能研究

為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質量可控，重組人源化膠原蛋白應參考相關行業標準進行必要的鑒別、純度和雜質等分析，可采用不同的分析方法對材料的分子量、等電點、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進行充分鑒定，并進行適當的檢測，以確認終產物具有預期的構象、聚集狀態、降解狀態及膠原蛋白高級結構。

材料理化特性分析需按照醫療器械制備工藝和特點，結合其風險控制要求進行相關研究，建議對如下常規理化項目進行研究，例如氨基酸序列、蛋白空間結構、劑型（如溶液、凍干粉、凝膠、纖維、海綿等）、膠原蛋白型別等特異性性能，同時結合醫療器械特點，完善理化性能指標要求。

需根據不同的預期用途及使用部位、不同生產工藝、預期使用效果和最終醫療器械的狀態，選擇適用的指標；根據膠原蛋白材料是否經過交聯或化學修飾，宜提供交聯劑或修飾劑的殘留量、降解周期等性能的檢測指標，提供相應的檢測報告。

檢測的必要性和純度等指標要求取決于膠原蛋白材料性質和用途、生產和純化工藝及生產工藝的經驗等多種因素。新的分析技術及對現有技術的改進正在不斷進行，適當時應使用這些新的技術。

1.鑒別

1.1氨基酸序列及覆蓋度

首先需明確氨基酸序列的選擇依據，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復次數及依據。需采用綜合的方法測定目標膠原蛋白材料的氨基酸序列，并與其基因序列對應的理論氨基酸序列進行比較驗證。肽段覆蓋率的檢測結果應為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測結果應與理論序列完全一致。

如適用，目標膠原蛋白材料的理論氨基酸序列應包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測定還應考慮可能存在的N端甲硫氨酸(如大腸桿菌來源的膠原蛋白材料），信號肽或前導序列和其他可能的N端、C端修飾（如乙酰化、酰胺化或者由于外肽酶導致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質性（如脫酰胺化、氧化、異構化、碎片化、二硫鍵錯配、N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等）。

1.1.1氨基酸組成 

使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導的氨基酸組成或天然異構體比較。如需要時應考慮分子量的大小。多數情況下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結構資料，但對大蛋白一般意義較小。在多數情況下，氨基酸定量分析數據可用于確定蛋白含量。

1.1.2氨基酸末端序列 

氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質和同質性。若發現目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發生改變時，應使用適當的分析手段判定變異體的相應變異數量。應將這些氨基酸末端序列與來自目的膠原蛋白基因序列推導的氨基酸末端序列進行比較。用氨基酸序列分析儀或質譜法測定N端和/或C端氨基酸序列，其結果應符合理論預測（每年應至少做一次）。

1.2 肽圖

按照《中華人民共和國藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進行測定，建立膠原蛋白材料標準肽圖。

推薦利用四極桿飛行時間串聯質譜儀（Q-TOF MS）建立標準肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩定性評價，以及材料特異性的鑒別。

應用合適的酶或化學試劑使所選的材料片段產生不連續多肽，應用HPLC或其他適當的方法分析該多肽片段。應盡量應用氨基酸組成分析技術，N-末端測序或質譜法鑒別多肽片段。對材料成品放行來說,經驗證的肽譜分析經常是確證目的材料結構/鑒別的適當方法。

1.3 分子量

對申報醫療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國藥典》高效液相色譜法、電泳法第五法SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳法，以及具有Marker的SDS-PAGE方法、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜方法建立分子量及分布檢測方法，也可以運用其他適當技術測定分子量，如分子篩層析法等。

高分辨質譜法分子量應與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置應與參比品一致。

1.4 等電點

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細管電泳法進行檢測，等電點應在標示范圍內，也可以運用其他適當的方法測定。

1.5 巰基和二硫鍵

如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時，應盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質譜測定法或其他適當的方法。

1.6 碳水化合物結構

應測定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，盡可能分析碳水化合物的結構、寡糖形態（長鏈狀）和多肽的糖基化位點。

1.7消光系數（或克分子吸光度）

多數情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長處測定消光系數（或克分子吸光度）。消光系數的測定為使用UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應用氨基酸組成分析技術或定氮法等方法測定。

1.8電泳圖型

應用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細管電泳法或其他適當的方法,獲得目的膠原蛋白材料的一致性,同一性和純度的電泳圖譜和數據。

1.9液相層析圖譜

應用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析或其他適當方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數據。

2.結構表征

2.1 氨基酸異質性分析

2.1.1 脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等

適用時，應按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求進行分析。

2.1.2 脯氨酸羥基化

若在設計是進行脯氨酸羥基化，應按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的規定進行分析，并規定標示值。

2.2 高級結構分析

鑒于高級結構與重組人源化膠原蛋白表現出的性能和功能密切相關，鼓勵采用多種方法對高級結構進行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結構表征方法，如冷凍電鏡、蛋白質晶體結構等方法。

2.2.1三螺旋結構 

可采用圓二色譜在特定實驗條件下的檢測結果反映膠原蛋白材料在該條件下可（否）具有形成三螺旋結構能力；可采用X射線晶體學技術或冷凍電鏡技術在原子結構水平考證膠原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋結構特性，計算有結構信息的序列占整個蛋白序列的百分比X%；可采用差示掃描量熱譜檢測膠原蛋白材料結構變化的熱效應輔助說明膠原蛋白的高級結構特征；可采用紅外光譜進行結構分析，其非特征區（如：酰胺a、b）和特征區（如:酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置應與參比品一致；可采用拉曼光譜，其拉曼光譜圖應與參比品一致；也可應用其它紫外或可見光吸收光譜法、核磁共振（NMR）等適當的方法檢測。

2.2.2纖維質量/多孔網狀結構

適用時，使用TEM 或AFM觀察膠原蛋白材形成膠原纖維束/多孔網狀結構等，須明確兩種方法具體的制樣和觀察測定過程。

3.純度

關于純度的要求可視醫療器械終產品的用途和用法而確定，作為原材料，建議一般應≥95%。

4.含量

應建立重組人源化膠原蛋白含量檢測方法，含量以質量/重量或質量/體積表示。含量檢測可通過液相色譜法（HPLC）、凱氏定氮法、特征多肽法等，應在標示量的90%～110%之間。

5.雜質、污染物和添加劑

對膠原蛋白材料工藝相關雜質以及外源污染物等進行研究，如：細胞基質來源、細胞培養來源和下游工藝。應對潛在的工藝相關雜質（如宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、細胞培養殘留物、下游工藝的殘留物等）進行鑒別、評估，并進行定性和/或定量分析，并采用適宜的方法評價其對生物學功能的影響。工藝相關雜質來源于生產工藝，可分三大類：來源于細胞基質、培養基和下游工藝。細菌內毒素、微生物限度和無菌性，是常規的污染物控制要求。

5.1源于細胞基質的雜質 

來源于細胞基質的雜質包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對于宿主細胞蛋白，一般應用能檢測出較寬范圍蛋白雜質的靈敏的免疫檢測方法。應用不含目的基因的生物體粗提物，即不含膠原蛋白編碼基因的生產用細胞，制備上述試驗使用的多克隆抗體。可通過對膠原蛋白材料的直接分析方法（如雜交技術法）檢測宿主細胞的DNA水平，和/或通過標記實驗（實驗室規模）檢測證實通過純化工藝能去除核酸。對于有意導入的病毒，應驗證生產工藝中去除/滅活病毒的能力。

5.1.1外源性DNA殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“外源性DNA殘留量測定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進行測定，“熒光染色法”的樣品加標回收率應滿足70%～130%；“定量PCR法”的樣品加標回收率應滿足50%～150%，應規定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測限，則應采用“定量PCR法”進行測定。

宜根據醫療器械產品的預期臨床用途（作為植人物在體內使用，還是作為敷料等在體表、粘膜使用）、使用量等，確定含重組膠原蛋白的材料臨床最大使用量的外源性DNA殘留量限值。如果重組膠原蛋白產品預期為體內植人劑，推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結合殘留DNA宿主類型及其風險程度設定每人每次最大使用量限值。

建議參考生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達的基因工程重組生物制品的外源性DNA殘留量限度，如注射用生物制品≤10ng/劑，CHO細胞表達的基因工程重組產品外源性DNA殘留量≤100pg/劑(10000IU）等。

5.1.2宿主細胞蛋白質殘留量

5.1.2.1大腸桿菌蛋白質殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質殘留量測定法”或采用經驗證的酶聯免疫試劑盒進行測定，其結果應在總蛋白的0.05%以下（體內植人）。

5.1.2.2酵母蛋白質殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“酵母工程茵茵體蛋白質殘留量測定法” 或采用經驗證的酶聯免疫試劑盒進行測定，其結果應在總蛋白的0.05%以下（體內植入）。

5.1.2.3 CHO細胞蛋白質殘留量

采用經驗證的酶聯免疫試劑盒進行測定，CHO細胞蛋白質殘留量應在總蛋白的0.05%以下（體內植入）。

5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）

采用經驗證的方法或經驗證的市售細菌肽聚糖檢測試劑盒（ELISA）檢測殘留肽聚糖，應根據其致熱反應風險規定可接受的限量要求。

5.2 源于培養基的雜質

來源于培養基的雜質包括誘導劑（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其他培養基組分。應根據工藝中采用的表達體系和使用的抗生素類型，采用經驗證的方法測定殘余抗生素含量/活性，殘余抗生素含量應≤50ng/mg，不應有殘余抗生素活性。

殘余抗生素含量的測定按照YY/T 1849《重組膠原蛋白》中描述的方法或其他經驗證的方法進行檢測，殘余抗生素活性按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 生物活性測定法中抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國藥典》 四部通則 抗生素殘留量檢查法進行檢測。

5.3 源于下游工藝產生的雜質

來源于下游工藝產生的雜質一般包括酶、化學/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質。需結合實際情況制定相關理化指標。

5.3.1 添加劑

如果使用了防腐劑、凍干保護劑等添加劑，應給出其限量要求和檢測方法。

5.3.2 重金屬及微量元素含量應符合以下規定。

5.3.2.1重金屬元素

對工藝中添加的重金屬元素，應符合規定限值。

5.3.2.2重金屬含量

重金屬總量（以Pb計）應≤10μg/g。

5.3.2.3微量元素含量

微量元素含量：砷（As）≤1 μg/g，汞（Hg）≤4 μg/g，鉛（Pb）≤10μg/g，鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）總量應≤50μg/g。

5.4 細菌內毒素

關于細菌內毒素相關限值需結合醫療器械終產品的用途及用法進行設定。

5.5 微生物限度

    若膠原蛋白材料以微生物限度控制狀態提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法和、非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢測，結果應符合相關要求。

5.6 無菌性

若膠原蛋白材料以無菌狀態提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 無菌檢查法進行檢測，結果應無菌。

6.分子變異體

建議對膠原蛋白材料的各種分子變異體進行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標產物一致時可不做雜質考慮。應考慮在生產和/或貯存期間膠原蛋白材料降解產物是否顯著增加及其與免疫原性的相關性。以下為最常見的目的膠原蛋白材料的分子變異體，并列出了相應的檢測方法：

6.1 化學修飾類型

應考慮脫酰胺、異構化、錯配S-S連接和氧化形式的分離和鑒別。對這些變異體的分離和鑒別，可應用層析法和/或電泳法（如HPLC、毛細管電泳、質譜法、圓二色譜）。

6.2 降解物和聚合體

降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體，可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進行定量；應建立降解物的判定標準，并對穩定性試驗產生的降解產物進行監測。

7.熱穩定性

如果重組膠原蛋白是多聚體，可采用差示掃描量熱分析（DSC）進行解聚溫度分析。可參考《中華人民共和國藥典》 四部。

如果是單鏈的蛋白肽，可參考《中華人民共和國藥典》 四部,人免疫球蛋白3.3.2.4熱穩定性試驗，將供試品置（57±0.5）℃水浴中保溫4 h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察應無凝膠化或絮狀物。

8.降解特性及產物

應對膠原蛋白材料降解特性進行研究，可采用GPC測定降解產物的分子量分布及分子量，水解/酶解產物可使用氨基酸分析儀、高效液相色譜或其他適宜的方法測定。

9.其它理化指標

膠原蛋白材料其它性能指標宜根據醫療器械終產品特性及相關通用要求制定，在適用時，需對相關性能指標檢測方法使用的對照品進行性能研究，對照品技術參數應明確且性能穩定。用于理化測定等方面的對照品，應進行必要的分析鑒定，包括但不限于：

9.1 外觀（如性狀、顏色）

用肉眼直接觀測，應為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

注：隨著行業發展，可能存在其他外觀要求，應根據原材料具體形態規定外觀要求。

9.2 可見異物

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 可見異物檢查法第一法（燈檢法）進行檢測，應無明顯異物。

9.3 溶解性

應根據供試品的溶解特性，對供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進行表征和闡述。稱取適量樣品，于25℃±2℃一定體積的溶劑中，每隔5min強力振搖30s；觀察30min內的溶解情況，如無目視可見的溶質顆粒或液滴時，即視為完全溶解。

 表7 水溶解性/鹽溶解性

 9.4 水分

適用時（如凍干樣品），水分含量應≤10%。除另有規定外，取供試品約1 g～2 g，按照《中華人民共和國藥典》“水分測定法”第二法（烘干法）測定，或取供試品約10 mg 按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測定，升溫程序：從室溫以10 ℃/min 速率升溫至105 ℃，保持60 min。減失重量應符合所標示范圍。規定仲裁方法為水分測定法。

9.5 熾灼殘渣

除另有規定外，取1.0-2.0g，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 熾灼殘渣檢查法進行檢測，結果應≤2%。

9.6 酸堿度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則“pH值測定法”進行檢測，應符合所標示值的±1.0，一般應在5.5-8.0之間。

9.7 滲透壓摩爾濃度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 滲透壓摩爾濃度測定法進行檢測，滲透壓摩爾濃度范圍應280-360 mOsmol/kg之間。

9.8 動力黏度（凝膠）

取供試品按照《中華人民共和國藥典》“黏度測定法”的“旋轉黏度計測定法”測定，需要詳細描述試驗條件，動力黏度值應符合所標示范圍。

9.9 裝量及差異

根據供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。單個裝量不低于標示裝量的93%,平均裝量不低于標示裝量。

9.10 掃描電鏡觀察

適用時，重組人源化膠原蛋白固體在掃描電鏡下觀察，圖像整體應與參比品保持一致。

10.生物學功能評價

重組膠原蛋白的生物學功能是指以重組膠原蛋白生物學特性相關屬性為基礎的生物學作用，對聲稱的生物學功能宜進行定性定量分析。膠原是細胞外基質的主要成分，重組膠原蛋白的主要生物學功能是為細胞提供支架和良好的微環境，如促進細胞黏附、增殖、生長、分化等。因此，可通過評價細胞-膠原蛋白相互作用來評價重組膠原蛋白的生物學功能。細胞增殖、分化、黏附性、遷移或移行評價方法可參考YY/T 1849《重組膠原蛋白》。

細胞在體內對基于膠原蛋白-細胞相互作用通過生物化學和生物物理兩個方面進行調控。膠原蛋白固有的細胞信號傳導能力在很大程度上受以下三個方面驅動：支持整合素介導的細胞粘附；通過結構和材料特性施加物理和機械的作用；參與細胞誘導的動態重建過程（如生物降解，結合生長因子，和微結構的變形）。

由于膠原類材料在分子組成、微結構、物理性能方面可能差異顯著，應檢測材料與細胞之間相互作用及其引導細胞基礎響應的性能。細胞響應的參數包括：細胞形態、面積和體積，均可通過二維（2D）或三維（3D）圖像技術可視化評價。細胞骨架成分（如肌動蛋白）的協同作用被用來評價細胞與基質間的粘附與收縮解離。

測試過程中，在膠原聚合之前通過把細胞混懸在膠原溶液中，細胞很容易進入自組裝膠原網內，或者將細胞接種到自組裝后的膠原材料表面。抗體阻斷試驗可用來確定細胞表面的何種受體參與了與膠原的作用，如整合素或盤狀結構域受體（DDRs）。

在單個細胞或多細胞水平上評價細胞引導的收縮解離的方法有多種。自由漂浮組織構建物的尺寸隨時間的變化、施加在培養-力學監測系統上力的大小、以及單個細胞在膠原網絡的應力和形變。

常規檢測的細胞響應參數還包括：存活率，增殖率，程序化凋亡以及遷移。

其它適用于干細胞和祖細胞類型的細胞-膠原相互作用的功能性檢測包括細胞株的定向分化，特定干細胞或祖細胞的增殖，或組織形態發生（始于內皮祖細胞的血管形成）。

按照《中華人民共和國藥典》 四部 進行成纖維細胞生長因子生物學活性測定，對膠原蛋白肽-細胞相互作用評價，反映膠原蛋白肽與成纖維細胞增殖的構效關系。按照《中華人民共和國藥典》 四部 生物活性測定法對試驗結果進行統計學分析，包括對驗證指標結果的繪圖和統計學分析，以及判斷其是否符合可接受標準等。常規的統計學方法一般要求數據之間相互獨立，并呈近似正態分布和方差齊性，通常采用相對效價的對數轉換值進行數據分析。當無法滿足上述統計學要求時，也可考慮采用其他適宜的替代方法進行數據分析。

上述關于膠原—細胞相互作用的功能性測定也可作為醫療器械產品標準化和質量控制的方法。三維支架材料中細胞活性評價方法可參考YY/T 1562《組織工程醫療器械產品 生物材料支架 細胞活性試驗指南》。

（二） 材料免疫學安全性研究

臨床前安全性評價包括臨床前安全性試驗，其目的主要是確定新膠原蛋白材料是否會在人體引起未能預料的不良反應，免疫學安全性研究是重組膠原蛋白材料生物安全性研究資料的主體。但是，用傳統生物試驗方法來評價重組膠原蛋白往往有困難，并受多種因素的影響。例如高度的種屬特異性，人的蛋白質對人的生物學活性遠高于對動物的活性，而且人的蛋白質氨基酸序列，常常與來自其它種系的蛋白質不同，例如糖基。因而由基因工程技術所制備的蛋白質或肽類往往會在人體以外的其它宿主中產生免疫應答，其生物學效應有所改變，并可能因形成免疫復合物而導致有毒性反應，而這樣產生的毒性反應與人體安全性顯然無關。

另外，由于重組膠原蛋白功能、生產工藝或者膠原蛋白材料穩定性等要求，對膠原蛋白材料進行修飾或者改構，應提供與未修飾或者改構材料比較的研究資料。以簡化生產工藝為目的而引入的額外多肽片段如His-tag，在最終的材料成品中應符合相關行業標準的要求。

1.免疫原及免疫化學檢驗

基于部分人膠原蛋白核酸序列進行編輯組合而重組的蛋白質產物，特別是長期反復使用時，可能引起人體預測不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性風險，宜增加免疫學研究。重組人源化膠原蛋白作為醫療器械用原材料，可采用適宜方法進行免疫學評價。若用動物進行免疫學試驗，可能因為動物模型與臨床應用之間存在種屬差異，帶來對評價試驗結果或評價試驗數據使用上的局限，應當根據臨床試驗獲得的免疫學評價數據及動物模型獲得的免疫評價數據進行綜合評價分析。

患者對蛋白質類材料產生免疫應答的風險將隨醫療器械產品變化而變化。建議采用基于風險的方法來評價和減輕與影響人源化膠原蛋白安全性和有效性相關的免疫應答。人源化膠原免疫原主要源自生產過程中殘留的可致免疫原性的各種因子，包括殘留的各種雜蛋白（包括DNA轉錄過程中可能產生的異種蛋白）、殘留的大腸桿菌及酵母菌外源性DNA、材料致熱原、生產過程中菌體產生的細菌內毒素、DAMPs以及人源膠原特異性免疫等等。

為降低人源化膠原蛋白材料的免疫原性風險，一般需在材料設計及生產工藝中采取相應處理措施以降低其免疫原性，如宿主細胞選擇，蛋白提取、蛋白純化。申請人需對其降低材料免疫原性的有效性進行驗證，并提供驗證實驗性數據或相關研究資料。申請人應提供免疫原性檢測范例的理論依據，應使用經完全驗證的檢測法對來自關鍵性研究的樣品進行檢測，并提供支持該檢測法的全面驗證的數據。

雜蛋白的檢測可參考YY/T 1453《組織工程醫療器械產品 I型膠原蛋白表征方法》，外源性DNA檢測可參考YY/T 0606.25《組織工程醫療產品 第25部分 動物源性生物材料DNA殘留量測定法：熒光染色法》。膠原蛋白材料的免疫原檢驗可通過流式細胞術（FCM）或酶聯免疫吸附法（ELISA）測定，檢測試驗宜考慮，但不限于淋巴細胞增殖試驗（YY/T0606.15《組織工程醫療產品 第15部分 評價基質及支架免疫反應的實驗方法：淋巴細胞增殖試驗》）、細胞遷移試驗（YY/T0606.20《組織工程醫療產品 第20部分：評價基質及支架免疫反應的試驗方法：細胞遷移試驗》），采用非標方法時應進行方法學驗證。

免疫原性檢測可設計為檢測不期望的生物或生理結果的抗體，重組人源化膠原蛋白抗體可能降低效果或者引起過敏等反應。抗體檢測的免疫原試驗可參考《中華人民共和國藥典》，選擇適宜的方法進行，包括橋聯或均相酶免疫法、放射免疫沉淀試驗等，并進行相關的方法開發和試驗驗證。試驗過程中，可根據滴度試驗和中和活性試驗進一步對 ADA 進行分析，還可進行額外的抗體特征分析，包括抗體分型、抗原表位鑒定及交叉反應評價。

篩選檢測法（也稱為結合抗體（BAb）檢測法）用于檢測與材料結合的所有抗體。使用確證性檢測法建立 BAb 對材料的特異性，使用滴定和中和檢測法進一步表征重組人源化膠原蛋白抗體。使用滴定檢測法表征抗體應答的量級，抗體對安全性和有效性的影響可能與其滴度和持續性而不是發生率相關。中和檢測法評估抗體干擾材料-靶標相互作用的能力。中和抗體（NAb）是 BAb 的亞類，ADA 對安全性和有效性的影響可能與 NAb 活性而不是抗體發生率相關。類似地，在一些情況下可能重要的是確定 NAb 滴度。用于檢測抗體的首選檢測法應當是檢測低親和力和高親和力抗體的高靈敏度篩選檢測法。申請人在開發檢測方法以確認重組人源化膠原蛋白特異性抗體結合時，應選擇合適的確證性檢測法以防止抗體假陽性數據，這些假陽性數據會混淆抗體對安全性和有效性影響的分析。

申請人應提供支持該檢測法的全面驗證的數據。驗證包括證明用于給定樣品中抗體的定量測量的特定檢測法對于預期用途是可靠和可重現的。抗體檢測法有助于評價材料的免疫原性，然而抗體的檢測依賴于檢測法的關鍵操作參數（如靈敏度、專屬性），一般來說，建議申請人開發針對靈敏度、專屬性、選擇性、精確度、重復性和穩定性進行優化后的檢測法。

其他的免疫原評價及生物學性能及生物相容性評價等建議做醫療器械終產品的檢測，因為加工工藝不同最終產品性能不同，例如有些交聯工藝可能會封閉某些免疫原反應簇等等。

2.免疫毒理學評價

當擬生產醫療器械免疫原性風險與已上市產品無可比性，且無充分的文獻數據評價其免疫原性，需進行免疫毒理學試驗研究。通過免疫毒理學試驗，對炎癥反應、免疫抑制、免疫刺激、超敏反應以及自身免疫進行確證評價，評估免疫系統改變導致的潛在人體不良健康作用。

免疫毒理學可通過流式細胞術（FCM）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、組織病理切片等方法測定，試驗方法可考慮結合生物學試驗、體外T淋巴細胞轉化試驗（YY/T 1465.1《醫療器械免疫原性評價方法第1部分體外T淋巴細胞轉化試驗》）等，申請人應對選用檢測方法的適用性進行評價，采用非標方法時應進行方法學驗證。

可參考GB/T 16886.20《醫療器械免疫毒理學試驗原則和方法》選擇性進行功能性或非功能性免疫毒理學試驗，通過嚙齒動物試驗方式檢測和評價物質的不良作用。目前主要研究方法是將醫療器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整個降解周期內機體的體液和細胞的免疫應答，以及局部組織的免疫反應。功能性檢測測定細胞和/或器官活性，例如淋巴細胞對有絲分裂原或特異性抗原的增殖反應、細胞毒活性和特異性抗體的形成；非功能性檢測涵蓋形態學方面和/或定量的術語、淋巴組織變化程度、淋巴細胞數目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能標志物。

（三） 材料生物學風險評價

作為制備醫療器械產品的原材料，建議參照GB/T 16886.1的要求對重組人源化膠原蛋白原材料進行相應必要的生物學評價，尤其通過膠原蛋白材料到醫療器械終產品的加工工藝分析發現，兩者之間的生物學風險相近時。針對醫療器械產品特性（接觸方式、接觸時間）進行生物學評價或試驗，提供膠原蛋白材料的生物相容性評價研究資料，包括：生物相容性評價的依據和方法、膠原蛋白材料的描述及與人體接觸的性質、實施或豁免生物學試驗的理由和論證、對于現有數據或試驗結果的評價。如預期用于植入產品的原材料，還應評估樣品是否為內源性凝血系統激活物。若醫療器械終產品與膠原蛋白材料的使用方法不一致，需考慮生物學補充研究。

首先根據YY/T 0316《醫療器械 風險管理對醫療器械的應用》描述的風險管理過程進行生物學風險評定，建議考慮預期使用/器械表征，識別材料、添加劑、加工助劑和其他潛在可瀝濾物中的危害，接觸劑量等因素，繪制基于風險管理的生物學評價流程圖。對器械的生物學風險進行逐一評估，并詳述風險控制措施。

如果醫療器械產品以非滅菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學評價試驗，宜考慮滅菌方式及滅菌對重組膠原蛋白的影響。

可能需要評價的生物學風險評定終點包括：

1.細胞毒性

2.致敏性

注射膠原、膠原止血劑等具有潛在生物可降解性材料或體內植入材料以及材料制備過程中新增化學成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應性產物可能存在于成品時需進行遲發型超敏反應試驗。

3.皮膚刺激性

傷口修復材料、膠原蛋白敷料等直接與皮膚表面、傷口或其他損傷部位接觸材料需進行皮膚刺激試驗。

4.皮內反應

注射膠原、膠原止血劑等具有潛在生物可降解性材料或體內植入材料以及材料制備過程中新增化學成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應性產物可能存在于成品時需進行皮內刺激試驗。

5.材料介導的致熱性

6.全身毒性

7.溶血性

血管修復材料、創傷和燒傷修復材料、膠原止血劑、心臟瓣膜等與循環血液接觸的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系統材料需進行溶血試驗。

8.植入反應

皮下植入（膠原支架、血管修復材料、創傷和燒傷修復材料、膠原止血劑等可降解/可吸收材料或需植入生物材料等需進行皮下組織植入試驗進行評價）；肌肉植入；骨植入。

9.遺傳毒性。

（四） 穩定性研究與直接接觸性容器/材料研究

1.穩定性研究

重組人源膠原合成表達系統如涉及到貯存，則需開展相應的穩定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運輸（如適用）和使用穩定性研究等。研究開展前，需統籌制定穩定性研究方案，關注各穩定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時間點、檢測條件和分析檢項等。

研究中需對能夠反映質量變化的敏感特征進行研究，如含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學活性等。研究中需涵蓋擬定的各項條件，如溫度、光照、反復凍融（冷凍貯存時）、振搖等方面。根據實際使用情況，開展使用中穩定性研究，例如復溶或解凍，與復溶稀釋劑的相容性等研究。研究中需采用與實際使用相同材質的直接接觸性容器/材料。

2.直接接觸性容器/材料研究

如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應的包材相容性研究。根據相容性研究結果，結合穩定性研究，選擇合理的包裝容器。

另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質、管路等），需開展風險評估和/或相應的相容性研究。

三、參考文獻

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[17] European Medicines Agency. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues [EB]. 2014-12-18

四、起草單位

國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心